锐帮读特发性慢性腹泻猕猴的粪便转录组

导读

特发性慢性腹泻（ICD）是幼年恒河猴发病和死亡的常见原因，通常伴随着肠道微生物的紊乱。尽管在少数病例中已观察到致病菌，但目前仍没有单一的病原体被确认为导致该疾病的原因。结肠中的大多数微生物依赖于复杂多糖的分解产物生存，这些产物来自宿主饮食或来自宿主来源的粘蛋白。本研究通过对猕猴粪便的转录组研究，将ICD猕猴和健康猕猴的转录产物进行比较，发现ICD宿主肠细胞合成的岩藻糖化粘蛋白增多，菌群对岩藻糖的利用发生变化，从而促进了致病菌的生存。

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文献ID

题目：Fecalmetatranscriptomicsofmacaqueswithidiopathicchronicdiarrhearevealsalteredmucindegradationandfucoseutilization

译文：特发性慢性腹泻猕猴的粪便转录组学揭示了粘蛋白的降解和岩藻糖利用率的变化

期刊名：《Microbiome》IF：10.

年份：年3月

通讯作者：DanielleG.Lemay

单位：美国加利福尼亚大学戴维斯分校基因研发中心

材料与方法

实验设计

样本收集：12个特发性慢性腹泻（ICD）和12个健康对照的幼年猕猴，样本年龄、生活环境取样前的一段时间内保持一致，在早餐后15分钟内收集粪便样本。

测序区域及平台

IlluminaHiSeq；PE；宏转录组

研究成果

1、猕猴宿主转录产物证实ICD组中炎症增加

分析比对到宿主的reads，对比健康组和ICD组的宿主转录产物丰度，在ICD组中有个宿主转录产物较健康组显著增加。图1所示，有10种宿主转录产物在ICD组中高表达，包括参与免疫信号传导的前列腺素G/H合成酶2（PTGS2）、巨噬细胞小体的主要成分FMNL1、经常被用作肠道炎症的标志物的蛋白质S-A9、促炎性细胞因子白细胞介素-1β（IL1β）等。这些在ICD组高度表达的基因表明来自ICD组的粪便样品含有表达促炎症谱的细胞。

图1：健康组和ICD组与丰度较高的宿主转录产物的相关性热图

2、ICD组和健康组样本的微生物多样性

分析比对到细菌转录产物的reads，使用Shannon和Simpson指数计算微生物多样性，健康组的shannon指数和Simpson指数都显著高于ICD组（p=1.e-5；p=2.e-5）（图2a，2b）。图2c中，主成分分析（PCA）证明健康组和ICD组明显分离。与健康组相比，ICD组中观察到更大的变异。全部样本的分级聚类也显示出健康组样本的聚类（图2d），而ICD组样本之间存在更大的异质性。

图2a，b：健康组和ICD组的粪便微生物组多样性指数；图2c：健康组和ICD组微生物转录谱的PCA分析；图2d：全部样本的分级聚类

3、健康组和ICD组在微生物特异性基因表达中具有显著差异

通过分析比对到微生物的reads，得到微生物转录产物的丰度，从而得出两组的微生物丰度。健康组样本中丰度较高的属为Prevotella,Bacteroides,Treponema,Ruminococcus等。而在ICD组中丰度较高的属为Prevotella,Bacteroides,Megasphaera,Eubacterium,Clostridium等（图3）。虽然健康组和ICD组中有许多相同菌属，但它们的相对丰度有较大的差异。其中，Prevotella的丰度差异最大，在ICD组中显著增加，另外，Bacteroides的丰度在ICD组也有所增加。

图3：健康组和ICD组粪便样品中微生物属水平丰度图

4、健康组和ICD组之间功能注释的差异

进一步探索微生物群落在健康组和ICD组之间的差异，将reads比对到SEED子系统层次结构的数据库，ICD组与健康组的比较揭示了两组在SEED层级类别中的变化。其中，在ICD组显著增加为膜转运，硫代谢和碳水化合物相关功能，显著减少的为次级代谢，休眠和孢子形成相关功能（图4）。细菌群落转录组的整体功能注释表明ICD组的粪便微生物组比健康组的粪便微生物组具有更好的营养物质。

图4：SEED子系统层次类别中的功能注释变化（ICD减少呈红色；ICD增加呈绿色）

5、来自细菌病原体的转录产物在ICD组中更丰富

研究分析了比对到已知细菌病原体的转录产物的数据：Camplyobactercoli(C.coli),Camplyobacterjejuni(C.jejuni),Helicobacterpylori(H.pylori）等，结果显示，虽然在健康组中也能检测到这些病原体的基因表达，但这些已知病原体的相对丰度在ICD样品中更高（图5）。在这些细菌病原体中，Camplyobacterjejuni是ICD组和健康组之间差异最大的。通过对该属特异性表达基因进行功能注释，认为Camplyobacterjejuni在ICD组中经历更多的氧化应激，更具粘附性并且可能更具毒性。

图5：健康组和ICD组中已知病原体相关的转录产物丰度水平

6、来自粘蛋白降解细菌和粘蛋白降解酶的转录产物在ICD中增加

比较已知的与炎症性肠病相关的细菌的转录产物的丰度，对于Ruminococcusgnavus，Ruminococcustorques，Bacteroidesthetaiotaomicron，Bacteroidescaccae和Bacteroidesfragilis，在ICD中观察到更高的转录水平（图6a），这些生物体与肠道上皮内侧形成的保护性粘蛋白层的降解和人类肠应激综合征的存在增加有关。接下来，研究了已知的与粘蛋白降解有关的特定酶的表达所产生的转录产物的丰度，粘蛋白降解酶在ICD组和健康组之间的表达有显著差异（图6b）。6种粘蛋白降解酶：α-和β-半乳糖苷酶，α-岩藻糖苷酶，α-甘露糖苷酶，N-乙酰葡糖胺酶和O-乙酰半胱氨酸酶的表达在ICD中均较高。

图6：与粘蛋白降解物种（a）和粘蛋白降解酶（b）相关的转录产物丰度水平

7、肠细胞合成ICD中的岩藻糖基化粘蛋白

来自健康组和ICD组动物的结肠切片用FITC缀合的凝集素染色，用于甘露糖和岩藻糖检测（图7a）。ICD组比健康组的岩藻糖显著更高（p=0.）（图7b），而甘露糖水平没有明显的差异。

另外，在样本中有较高表达的粘蛋白转录产物是粘蛋白-12（MUC12），粘蛋白-2（MUC2），粘蛋白-17（MUC17）和粘蛋白-13（MUC13），这些粘蛋白都由结肠中的肠细胞表达。相比于健康组，它们在ICD组中均显著增加。岩藻糖基转移酶，半乳糖苷3（4）-L-岩藻糖基转移酶（FUT3）在ICD中的表达更高。总之，结肠切片的免疫组织化学和宿主细胞转录组的分析表明ICD与岩藻糖基化粘蛋白的增加有关。

图7a：用于检测甘露糖和岩藻糖的猕猴结肠切片染色；图7b：甘露糖和岩藻糖信号的平均像素强度

8、ICD中的岩藻糖利用率

研究发现ICD组的肠细胞粘蛋白和岩藻糖基转移酶-3在宿主转录组中升高，结肠切片的免疫组织化学也表明ICD中岩藻糖的存在率较高。Bacteroides在ICD中表达更多的α-L-岩藻糖苷酶，从岩藻糖基化粘蛋白中释放出岩藻糖，从而增加游离岩藻糖的量。Prevotella和Haemophilus增加了岩藻糖通透酶的表达，这将使它们能够增加游离岩藻糖的摄取，可能会改善它们在ICD中的持久性。Campylobacter没有表达较多的产生岩藻糖的转录物，而是表达了更多的粘附蛋白转录物，如cadF，使它能够粘附岩藻糖基化的粘蛋白。

图8：ICD中使用岩藻糖的机制概述

研究结论

1、研究发现，在特发性慢性腹泻猕猴中，肠道微生物多样性降低，宿主炎症相关基因表达增加。

2、健康组和ICD组在微生物特异性基因表达中具有显著差异，其中，Prevotella的丰度差异最大。

3、来自C.coli、C.jejuni等细菌病原体的转录产物在ICD组中更丰富。

4、从ICD与粘蛋白降解增加相关的假设出发，发现了ICD中的粘蛋白降解细菌和粘蛋白降解酶的转录产物比健康组相对更多，ICD中粘蛋白降解酶的微生物基因的相对较高表达提示功能失调的微生物组能够降解粘液屏障。

5、ICD期间，宿主产生岩藻糖化的粘蛋白，被微生物作为碳源或作为粘附位点利用，使潜在的致病物种能够持续存在。

亮点

研究通过宏转录组学分析，揭示了微生物-微生物和宿主-微生物相互作用。虽然ICD的病因尚不明确，但本研究对宿主转录产物、病原体和病原体转录产物的发现和分析，为明确ICD病因提供了一些线索。

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供稿：吴琼

编辑：鲁淑妮

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